Стаття була опублікована в журналі "Проблеми репродукції" № 5, 2009.

Автори:к.б.н., ембріолог Д.А. Ісаєв, вр.-репродуктолог В.В. Заева, ембріолог Р.В. Бакурадзе, ембріолог І.С. Крівохарченко, вр.-репродуктолог С.Ю. Залєтов

В даний час заморожування в рідкому азоті є єдиним надійним і широко поширеним способом зберігання сперми людини і тварин. В кінці 40-х р.р. минулого століття C. Polge і співавт. [1] успішно застосували гліцерин в якості кріопротекторів для заморожування сперми тварин. Кріоконсерванти на основі гліцерину донині залишаються кращими, забезпечуючи досить високу виживаність сперми після розморожування.

Кріоконсервація в рідкому азоті має недоліки, найбільш істотним з яких є транспортування, в т.ч. авіатранспортіровка з подоланням митних кордонів, що вимагає дотримання строгих обмежень при використанні рідкого азоту.

Часто в практиці ЕКО потрібно збереження сперми протягом декількох днів або тижнів. У цих випадках біохімічна консервація без заморожування в рідкому азоті могла б стати більш простим і економічним способом зберігання. Допускається також використання цього підходу для так званого "накопичувального" зберігання сперми пацієнтів з олігозооспермія з метою проведення подальшої штучної інсемінації [2].
Запропонований в 1996 р K. Saito і співавт. новий спосіб зберігання сперми людини при +4 0C в безсольової водному розчині глюкози є, очевидно, найбільш ефективним способом зберігання без заморожування [3]. Механізм підтримки життєздатності сперми в такій безелектролітной середовищі (БЕС) не ясний; можливо, що, при блокуванні на холоді Na +/K +-АТФази і в відсутність електролітичних іонів, глюкоза в ізотонічної концентрації перешкоджає гіпоосмотіческому поразці.

За різними оцінками дослідників, в організмі ссавців сперматозоїди можуть зберігатися в cauda epididymis від декількох днів до декількох тижнів [4] при температурах, лише незначно нижче температури тіла. Одним з шляхів збереження сперми без заморожування є імітація умов збереження в епідідіміса, що передбачає розробку подібних біохімічних складів і/або пошук специфічних інгібіторів метаболізму [5-7].

У клітинах епітелію епідідіміса людини встановлена ??висока активність альдозоредуктази і сорбітолдегідрогенази, що перетворюють глюкозу у фруктозу; ці два ферменти присутні також в епідідімосомах, що надходять у просвіт епідідіміса апокрінних шляхом [8]. Виходячи з цього, ми припустили, що зберігання в розчині фруктози більш відповідає природному стану спокою сперматозоїдів в епідідіміса.

Матеріал і методи

Використовували 22 зразка капацітірованной сперми , що залишилася після виконання фертилізація in vitro в програмах лікування безпліддя. Сперма була підготовлена ??з використанням набору "SupraSperm System" (MediCult, Данія) у відповідності з доданою інструкцією [9]. Після поділу в градієнті щільності супернатант видаляли, осад розчиняли у 3 мл середовища "FertiCult Flushing medium" (FertiPro, Бельгія) і повторно центрифугували.

Для консервації використовували середовище БЕС по Saito і співавт., Що представляє собою водний розчин 0,33 М глюкози і 3% БСА [2,3], а також середовище БЕС-Ф, де глюкоза була замінена на фруктозу в тій же концентрації. Осмоляльність середовища вимірювали на осмометрі "Омка 1Ц-01" і доводили моносахаридом до 320 мОсм/кг. По 30 мкл відмитого осаду сперматозоїдів кожного зразка поміщали в стерильні пробірки і розводили, відповідно, в 2 мл БЕС та БЕС-Ф. Пробірки зі зразками поміщали в холодильник і зберігали при температурі +4 0С протягом 2 тижнів.

Після зберігання зразки осаджували центрифугуванням протягом 10 хв при 300 G, акуратно видаляли консервант і розчиняли осад у 100 мкл середовища "FertiCult IVF medium "(FertiPro Бельгія). Отриману суспензію сперматозоїдів розводили тій же середовищем до концентрації 0,1 млн/мл і інкубували протягом 2 год при +37 0С в атмосфері трехгазовой суміші (5% CO2; 5% O2; 90% N2).

рухливість сперматозоїдів визначали відповідно до рекомендацій ВООЗ [10], підраховували також частку сперматозоїдів з ознаками гіпоосмотіческого поразки.

Результати представлені у вигляді M ± m, де М - середнє, m - стандартна помилка середнього. Оцінку відмінностей в рухливості і гіпоосмотіческом ураженні після зберігання в двох консервантах проводили по парному Т-критерію Вілкоксона. Для виявлення зв'язку між показниками життєздатності після ревіталізації та вихідними показниками нативного еякуляту застосовували непараметричний кореляційний аналіз Спірмена. Розрахунки та підготовку ілюстративного матеріалу виконували з використанням пакета програм STATISTICA 5.0 (StatSoft, Inc.)

Результати та обговорення

Відновлення рухливості. Відновлення рухливості після ревіталізації в середовищі "FertiCult IVF medium" спостерігали протягом 2 год, оскільки інкубація протягом більш тривалого часу не призводить до збільшення числа рухливих сперматозоїдів. При підрахунку враховували тільки сперматозоїди з поступальним рухом (категорії А і B).

Обробка сперми в двухступенчатом градієнті щільності забезпечує присутність у вихідній суспензії не менше 80% прогресивно-рухливих сперматозоїдів [11 ], тому ми не проводили додаткової оцінки рухливості в зразках безпосередньо перед консервацією.

Рухливість після зберігання в БЕС та БЕС-Ф склала 56,2 ± 5,0% та 42,6 ± 4,7% ( N = 22) відповідно (рис.1.).

По парному Т-критерію Вілкоксона для ? = 5%, встановлені достовірні відмінності між процентним вмістом рухливих сперматозоїдів в зразках після зберігання в БЕС та БЕС-Ф (Т = 1,0; N = 22; р = 0,00).

Гіпоосмотіческое поразку. У гіпоосмотіческіх умовах у сперматозоїдів спостерігається характерне скручування джгутика в результаті руйнування або розтягування мембрани жгутиковой частини. Це властивість сперматозоїдів використовується в якості тесту на життєздатність - HOST (англ. hypo-osmotic swelling test - тест на гіпоосмотіческое розбухання) [12]. В результаті зберігання на холоді без заморожування і подальшої ревіталізації у сперми також спостерігаються характерні для гіпоосмотіческого поразки ознаки - HOS-форми, незважаючи на ізотонічність або навіть гіпертонічно консерваційною середовища. Це може відбуватися з кількох причин: зниження на холоді активності Na +/K +-АТФази, дифузія в клітку Na + і, як наслідок, обводнення цитоплазми; злежування сперми в процесі зберігання і руйнування мембран; осмотичні перепади в результаті нагрівання-охолодження і зміни середовища при ревіталізації . Таким чином, присутність HOS-форм може служити показником стійкості сперми до зберігання.

Зміст HOS-форм після зберігання в БЕС та БЕС-Ф склало 5,0 ± 0,6% і 14,2 ± 3, 2% (N = 22) відповідно (рис.2.). По парному Т-критерію Вілкоксона для ? = 5%, встановлені достовірні відмінності між змістом HOS-форм в зразках після зберігання в БЕС та БЕС-Ф (Т = 1,0; N = 22; р = 0,00). При зберіганні в БЕС-Ф відносна кількість HOS-форм значно варіює, але в середньому майже в 3 рази вище, ніж в БЕС.

Індивідуальні особливості сперми. З метою виявити можливий вплив індивідуальних особливостей на збереження життєздатності в різних середовищах, вибір зразків був проведений випадковим чином, без урахування якості сперми, а кожен зразок був розділений на рівні аліквоти для зберігання в різних консервантах в одних і тих же умовах.

В отриманих нами даних про відновлення рухливості і наявності HOS-форм спостерігаються індивідуальні відмінності в стійкості до зберігання незалежно від консерванту і показників нативного еякуляту. Встановлена ??сильна кореляція по Спирмену між кількістю рухливих сперматозоїдів, що зберігалися в БЕС та БЕС-Ф (RS = 0,95; N = 22; p = 0,00), а також слабка кореляція між кількістю HOS-форм в обох консервантах (RS = 0,45; N = 22; p = 0,03). У той же час, не встановлено кореляції між рухливістю сперматозоїдів в нативному еякуляті до обробки та показниками життєздатності після зберігання в БЕС та БЕС-Ф.
Отримані нами дані свідчать про те, що стійкість до зберігання без заморожування, подібно кріорезістентності, є властивістю, не пов'язаним з вихідної рухливістю і морфологією, але, скоріше, з функцією клітинних мембран [13].

Висновок

Консервація та зберігання сперми без заморожування в рідкому азоті відкриває нові можливості для планування репродуктивних процедур в програмах ДРТ. Використання безелектролітних середовищ на основі моносахаридів є найбільш ефективним підходом до вирішення цього завдання. Використані нами в даній роботі консерванти на основі глюкози і фруктози забезпечують хорошу схоронність сперми при +4 0С протягом, щонайменше, 2 тижнів; в той же час, глюкоза є кращою, забезпечуючи, в середньому, майже на 14% більш високу виживаність в порівнянні з фруктозою. Необхідно також відзначити, що стійкість сперми до зберігання без заморожування, очевидно, не пов'язана з такими показниками нативного еякуляту як обсяг, рухливість і кількість ефективних сперматозоїдів.

ЛІТЕРАТУРА
1. Polge C., Smith A.U., Parkers A.S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature 1949; 164: 666.
2. Kanno H., Saito K., Ogawa T., Takeda M. et al. Viability and function of human sperm in electrolyte-free cold preservation. Fertil Steril 1998; 69: 127-131.
3. Saito K., Kinoshita Y., Kanno H. et al. A New method of the electrolyte-free long-term preservation of human sperm at 4 ° C. Fertil Steril 1996; 65: 1210-1213.
4. Jones R. Sperm survival versus degradation in the Mammalian epididymis: a hypothesis. Biol Reprod 2004; 71: 1405-1411.
5. Setchell BP, Sanchez-Partida LG, Chairussyuhur A. Epididymal constituents and related substances in the storage of spermatozoa: a review. Reprod Fertil Dev 1993; 5: 601-612.
6. De Pauw I.M., Van Soom A., Mintiens K. et al. In vitro survival of bovine spermatozoa stored at room temperature under epididymal conditions. Theriogenology 2003; 59: 1093-107.
7. Verberckmoes S., Van Soom A., Dewulf J. et al. Storage of fresh bovine semen in a diluent based on the ionic composition of cauda epididymal plasma. Reprod Domest Anim 2004; 39: 410-416.
8. Frenette G., Thabet M., Sullivan R. Polyol pathway in human epididymis and semen. J Androl 2006; 27: 233-239.
9. http://www.medicult.com
10. Керівництво ВООЗ по лабораторному дослідженню еякуляту людини і взаємодії сперматозоїдів з цервікальним слизом. М.: "МЕДпресс", 2001. 4-е изд. під. ред. Л.Ф. Курило. 144 с.
11. Sцderlund B., Lundin K. The use of silane-coated silica particles for density gradient centrifugation in in-vitro fertilization. Hum Reprod 2000; 15: 857-860.
12. Jeyendran R.S., Zaneveld L.J. Human sperm hypo-osmotic swelling test. Fertil Steril 1986; 46: 151-152.
13. Коренев В.І., Калініна Е.А., Лукін В.А. Кріоконсервація сперматозоїдів людини. Проблеми репродукції 2000; 6 (1): 50-53.

Медична Клініка репродукції МАМА [email protected], Москва


Стаття отримана: www.ma-ma.ru

Детальніше »